대한당뇨병학회 E- Newsletter VOL 007

췌장의 베타세포에서 분비된 인슐린은 주로 골격근, 간, 지방조직에 작용하여 포도당(당)흡수를 촉진하고 당원과 지방의 합성을 증가시킨다. 이러한 인슐린의 작용이 감소되는 상태를 인슐린 저항성이라고 하며 인슐린 민감도(insulin sensitivity)가 감소되어 있다. 인슐린 저항성이 발생하면 보상적으로 인슐린 분비가 증가하는데 인슐린 분비가 증가하지 못하면 당뇨병이 발생할 수 있다. 동물실험에서는 대조군과 비교하여 실험군에서 인슐린 민감도가 감소한 경우 인슐린 저항성이 발생한다고 해석한다.

동물실험에서 인슐린 민감도와 인슐린 분비를 측정하는 이유는 다양하지만 주로 유전자 변형 생쥐에서 변형된 유전자가 당대사에 미치는 영향을 측정하거나 특정 약물이나 물질의 인슐린 분비 및 인슐린 저항성 개선 유무를 측정하고자 할 때 시행한다. 유전자 변형 생쥐에서는 정상식이 섭취군과 고지방식이 섭취군으로 나누어 실험하는데 정상식이 군에서는 발현되지 않은 유전자의 표현형이 인슐린 저항성이 유도된 고지방식이 비만군에서 발현될 수 있기 때문이다. 약물의 인슐린 저항성 개선 여부를 측정할 때는 주로 고지방식이 비만 생쥐 및 ob/ob, db/db와 같은 당뇨병 생쥐 모델을 이용하여 효과 및 작용기전을 분석한다.

동물실험을 진행할 때 식이 섭취 시작과 동시에 주기적으로 체중과 식이 섭취량을 측정한다. 이는 식이 섭취량의 변화가 유전자 또는 약물에 의한 식욕 조절 변화, 약물의 독성 등과 연관되어 있기 때문으로 식이 섭취량이 변화한 이유에 대한 분석이 필요하다. 대조군과 비교하여 실험군의 식이 섭취량이 변화하지 않은 경우 인슐린 민감도와 인슐린 분비를 분석한다. 체중 및 지방조직 양의 변화는 당대사에 밀접히 연관되어 있으므로 이러한 변화가 관찰된다면 인슐린 민감도의 변화를 예측할 수 있다. 공복혈당과 공복 혈중 인슐린 수치를 측정하고 이를 바탕으로 homeostasis model assessment (HOMA)-insulin resistance (IR), HOMA-β, quantitative insulin-sensitivity check index (QUICKI)를 계산한다.

공복혈당 및 인슐린 측정 다음으로 당내성검사를 실시한다. 당내성검사는 당 주입 후 시간에 따라 혈당 및 인슐린 농도를 측정하는 것으로 일반적으로 경구 투여 또는 복강 투여를 통해 당을 주입하나 소화계에서의 당흡수에 대한 유전자, 약물 등의 영향을 알 수 없는 경우 복강 주입이 추천된다. 당내성검사 결과, 대조군 대비 실험군에서 혈당이 높고 인슐린이 높은 경우와 혈당은 동일하나 인슐린 농도가 높은 경우는 인슐린 민감도가 감소된 것이므로 인슐린 내성검사를 시행한다. 인슐린 농도 감소 또는 인슐린 농도의 변화없이 혈당이 증가한 경우는 인슐린 분비 이상이 더 중요할 수 있으므로 인슐린 분비 분석과 필요에 따라 인슐린내성검사를 시행한다. 대조군과 실험군에서의 혈당과 인슐린 농도 차이는 각 측정 시간에 따라 통계적으로 비교하는 방법과 곡선 아래의 면적(area under curve)을 계산하여 비교하는 방법이 있다.

인슐린내성검사는 인슐린 주입 후 시간에 따라 혈당을 측정하며 대조군 대비 실험군의 혈당이 특정한 시간에서 증가하는 경우 인슐린 저항성이 있다고 한다. Area under curve를 계산하여 비교할 수도 있다. 대조군과 실험군의 공복혈당이 차이가 나는 경우 시간별 혈당을 공복혈당 대비 %로 나타내면 인슐린 민감도에 대한 더 정확한 분석이 가능하다.

인슐린 민감도가 통계적으로 차이가 나는 경우 인슐린 저항성이 발생하는 조직을 특정하기 위하여 hyperinsulinemic-euglycemic clamp를 시행한다. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp는 인슐린 민감도를 측정하는 gold-standard로 알려져 있는데 supra-physiological한 농도의 인슐린(hyperinsulinemia)을 주입하면서 혈당을 100~120 mg/dl로 일정하게 유지(euglycemia)하기 위하여 외부에서 당을 주입한다. 일정한 당의 농도를 유지하기 위하여 외부에서 주입하는 당의 양을 glucose infusion rate(GIR)라고 한다. 이때 두가지 종류의 동위원소로 표지 된 당을 주입하여 전신 및 골격근, 간, 지방조직 등의 인슐린 민감도를 측정할 수 있다. Clamp를 통하여 전신의 glucose turnover rate(GTR), 골격근과 지방조직의 glucose uptake(GU), 간의 glucose production rate(HGP)를 측정할 수 있다. 골격근과 간의 인슐린 저항성이 동시에 발생한 경우 GIR, GTR, 골격근의 GU가 감소하고 간의 HGP이 증가한다. 골격근에 인슐린 저항성이 발생한 경우 GTR와 골격근의 GU가 감소하며 간의 인슐린 저항성이 발생한 경우 GIR가 감소하고 간의 HGP이 증가한다. 이러한 결과를 토대로 인슐린 저항성이 발생한 조직에서 인슐린 신호전달계 활성을 분석하면 된다.

인슐린의 분비는 혈장 인슐린과 C-펩티드 농도 측정 및 췌장 조직 내 랑거한스 크기 측정, 면역조직화학 염색법을 이용한 인슐린 염색 등으로 분석할 수 있다. 인슐린 분비를 직접 측정하기 위해서는 실험동물의 췌장 조직에서 랑거한스를 선택적으로 골라 여러 농도의 당으로 자극하고 분비되는 인슐린을 측정할 수 있다(ex vivo glucose-stimulated insulin secretion). 실험동물에서 hyperglycemic clamp를 실시하여 인슐린 분비를 측정할 수도 있는데 외부에서 당을 주입하여 혈당을 약 300 mg/dl로 유지하면서 혈장의 인슐린을 측정한다. 대조군 대비 실험군의 인슐린 농도가 감소되어 있으면 실험군 췌장의 인슐린 분비능에 이상이 발생한 것으로 판단한다.

이상 설명한 당대사 연구방법은 동물실험에서 주로 기초 연구에 많이 사용되는 방법이며 이외에도 다양한 in vitro, in vivo 실험 기법이 사용되고 있다. 또한 새로운 실험 기법이 추가되고 있어 좋은 연구를 하기 위해서는 지속적인 최신의 실험 기법 습득이 필요하다.